IPTG (isopropil-β-D-tiogalactoside) minangka analog saka substrat β-galaktosidase, sing bisa diinduksi kanthi dhuwur. Ing induksi IPTG, induser bisa mbentuk kompleks karo protein represor, saengga konformasi protein represor diganti, saengga ora bisa digabungake karo gen target, lan gen target diekspresikan kanthi efisien. Dadi kepiye konsentrasi IPTG kudu ditemtokake sajrone eksperimen? Apa luwih gedhe luwih apik?
Kapisan, ayo padha mangerteni prinsip induksi IPTG: operon laktosa (unsur) E. coli ngandhut telung gen struktural, Z, Y, lan A, sing ngode β-galaktosidase, permease, lan asetiltransferase. lacZ nghidrolisis laktosa dadi glukosa lan galaktosa, utawa dadi allo-laktosa; lacY ngidini laktosa ing lingkungan ngliwati membran sel lan mlebu sel; lacA nransfer gugus asetil saka asetil-CoA menyang β-galaktosida, sing kalebu mbusak efek Toksik. Kajaba iku, ana urutan operasi O, urutan wiwitan P lan gen pengatur I. Kode gen I minangka protein represor sing bisa kaiket ing posisi O saka urutan operator, saengga operon (meta) direpresi lan dipateni. Ana uga situs pengikatan kanggo situs pengikatan protein aktivator gen katabolik-CAP ing ndhuwur urutan wiwitan P. Urutan P, urutan O lan situs pengikatan CAP bebarengan mbentuk wilayah pengatur operon lac. Gen-gen pengkode saka telung enzim kasebut diatur dening wilayah pangaturan sing padha kanggo entuk ekspresi produk gen sing terkoordinasi.
Tanpa laktosa, operon lac (meta) ana ing kahanan represi. Ing wektu iki, represor lac sing diekspresikan dening urutan I ing sangisore kontrol urutan promotor PI kaiket karo urutan O, sing nyegah RNA polimerase saka kaiket karo urutan P lan nyegah inisiasi transkripsi; nalika laktosa ana, operon lac (meta) bisa diinduksi. Ing sistem operon (meta) iki, inducer sing sejatine dudu laktosa dhewe. Laktosa mlebu ing sel lan dikatalisis dening β-galaktosidase kanggo diowahi dadi allolactose. Sing terakhir, minangka molekul inducer, kaiket karo protein represor lan ngganti konformasi protein, sing nyebabake disosiasi protein represor saka urutan O lan transkripsi. Isopropylthiogalactoside (IPTG) duwe efek sing padha karo allolactose. Iki minangka inducer sing kuat banget, sing ora dimetabolisme dening bakteri lan stabil banget, mula digunakake sacara wiyar ing laboratorium.
Kepriye carane nemtokake konsentrasi IPTG sing optimal? Umpamane E. coli.
Galur E. coli BL21 sing direkayasa sacara genetik sing ngandhut pGEX rekombinan positif (CGRP/msCT) diinokulasi menyang medium cair LB sing ngandhut 50μg·mL-1 Amp, lan dikultur sewengi ing suhu 37°C. Kultur ing ndhuwur diinokulasi menyang 10 botol medium cair LB seger 50mL sing ngandhut 50μg·mL-1 Amp kanthi rasio 1:100 kanggo kultur ekspansi, lan nalika nilai OD600 yaiku 0,6~0,8, IPTG ditambahake menyang konsentrasi pungkasan. Yaiku 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0mmol·L-1. Sawisé induksi ing suhu lan wektu sing padha, 1 mL larutan bakteri dijupuk saka larutan kasebut, lan sel bakteri dikumpulake kanthi sentrifugasi lan dikenakake SDS-PAGE kanggo nganalisis pengaruh konsentrasi IPTG sing beda-beda marang ekspresi protein, banjur pilih konsentrasi IPTG kanthi ekspresi protein paling gedhe.
Sawise eksperimen, bakal ditemokake yen konsentrasi IPTG ora sak gedhene. Iki amarga IPTG nduweni keracunan tartamtu kanggo bakteri. Ngluwihi konsentrasi uga bakal mateni sel; lan umume, kita ngarep-arep yen protein sing luwih larut sing diekspresikan ing sel, luwih apik, nanging ing pirang-pirang kasus nalika konsentrasi IPTG dhuwur banget, akeh inklusi bakal kawangun. Awak, nanging jumlah protein sing larut mudhun. Mulane, konsentrasi IPTG sing paling cocog asring ora luwih gedhe luwih apik, nanging luwih murah konsentrasine.
Tujuan induksi lan budidaya galur rekayasa genetika yaiku kanggo nambah asil protein target lan nyuda biaya. Ekspresi gen target ora mung dipengaruhi dening faktor galur kasebut dhewe lan ekspresi plasmid, nanging uga dening kahanan eksternal liyane, kayata konsentrasi induser, suhu induksi lan wektu induksi. Mulane, umume, sadurunge protein sing ora dingerteni diekspresikan lan dimurnèkaké, luwih becik nyinaoni wektu induksi, suhu lan konsentrasi IPTG kanggo milih kahanan sing cocog lan entuk asil eksperimen sing paling apik.
Wektu kiriman: 31 Desember 2021